From molecular targets to antitumor immunity

This thesis aimed at the development of strategies that could contribute to the evaluation of the clinical potential of new anticancer therapies. The work was divided into two main sections comprising the development of a therapeutic approach to target cancer genetic vulnerabilities and the development of 3D tumor models incorporating cues from the stromal and immune microenvironments. (...

Novel human central nervous system 3D in vitro models: useful tools for evaluation of viral vector-mediated gene delivery

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012A prevenção e tratamento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, estão ainda longe de se tornarem realidade. Embora as estratégias farmacológicas convencionais se tenham revelado pouco eficazes, resultados preliminares indicam que a terapia génica poderá ter grande potencial. Os vectores adenovirais baseados no serotipo canino 2 (CAV-2) transduzem preferencialmente neurónios em modelos animais, tendo o potencial de ser transportados a longa distância no cérebro via transporte axonal. A expressão epissomal a longo prazo permite uma entrega eficiente do material genético especificamente em neurónios. A aplicação da terapia génica está, no entanto, dependente da resolução de uma série de questões ainda em aberto - em particular, a necessidade de avaliar a sua exequibilidade, eficácia e segurança. O projecto europeu BrainCAV (www.braincav.eu), no qual este plano de trabalhos de mestrado está integrado, propõe-se avaliar o potencial de vectores CAV-2 para gerar modelos celulares geneticamente modificados que permitam estudar os mecanismos moleculares da doença de Parkinson (por introdução de genes com mutações associadas à doença) e como abordagem terapêutica para doenças neurodegenerativas. Tendo em vista a potencial aplicação dos vectores CAV-2 em ensaios clínicos, será necessário, numa primeira fase, avaliar estes efeitos em células humanas de cérebro. Dada a complexidade do sistema nervoso central (SNC), nomeadamente a importância da interacção neurónio-astrócito, é difícil encontrar modelos celulares adequados. Os modelos bi-dimensionais tradicionais de cultura têm-se mostrado ineficazes na recapitulação da fisiologia dos tecidos vivos. Assim, torna-se necessário recorrer a modelos tridimensionais, que apresentem os diferentes tipos celulares do SNC e que recapitulem as interações celulares no contexto tridimensional (3D) em que ocorrem. Visto isto, o principal objectivo deste trabalho era o desenvolvimento de um modelo celular 3D do SNC humano, com aplicação no estudo da doença de Parkinson. Para tal foram utilizadas células percursoras neurais derivadas do mesencéfalo fetal (hmNPCs), que apresentam capacidade de diferenciação nas 3 principais linhagens neurais (neurónios, astrócitos e oligodendrócitos), com forte potencial de diferenciação na linhagem dopaminérgica. Estas células são derivadas da região cerebral que, no adulto, é particularmente afectada com a doença de Parkinson, uma patologia que envolve, entre outros sintomas, a perda progressiva de neurónios dopaminérgicos na zona sub-ventricular do cérebro. Uma metodologia para a geração de neurosferas de hmNPCs diferenciadas tinha sido previamente desenvolvida na unidade de tecnologia de células animais (ITQB-UNL/IBET) [1]. Este processo recorre a sistemas de agitação orbital – erlenmeyers – que são mantidos numa incubadora com atmosfera controlada. Tendo em vista as potenciais aplicações referidas, neste trabalho procedeu-se a uma caracterização detalhada, nomeadamente em termos de fenótipo dopaminérgico e em termos funcionais. A caracterização fenotípica com recurso a técnicas de análise de expressão génica (qRT-PCR) e análise proteica (microscopia de fluorescência e Western blot) revelou que no final do protocolo de diferenciação (uma fase de agregação das células, durante 7 dias, seguida de uma etapa de diferenciação, durante 14 dias) a cultura era composta por uma elevada percentagem de células neuronais. Estas apresentavam marcadores típicos de neurónios maturos (βIII-Tubulin+/MAPS+/Sinaptofisina+, este último num padrão de marcação vesicular, indicativo de vesículas pré-sinápticas). Considerando o objectivo futuro de desenvolver um modelo celular de doença de Parkinson, a diferenciação na linhagem dopaminérgica nesta cultura foi também analisada. No final da diferenciação verificou-se um enriquecimento em neurónios dopaminérgicos nas neurosferas. No entanto, os níveis atingidos mantiveram-se abaixo dos valores obtidos quando estas células são diferenciadas em sistemas bi-dimensionais. A reduzida expressão do factor de transcrição Nurr1, envolvido na manutenção e diferenciação terminal de neurónios dopaminérgicos, sugeriu que as culturas 3D diferenciadas se encontravam num estádio de maturação anterior ao observado nas culturas 2D diferenciadas. Assim, com o objectivo de aumentar a eficiência da diferenciação dopaminérgica, o período de diferenciação foi prolongado; após os 14 dias de diferenciação a cultura foi mantida em condições de maturação (sem morfogéneos), o que permitiu a manutenção de neurosferas diferenciadas em cultura por mais 18 dias, com elevada viabilidade. Adicionalmente foi observado um aumento significativo na expressão de TH, o gene que codifica para a enzima tirosina hidroxilase, da via de produção de dopamina, indicando que a diferenciação dopaminérgica foi favorecida pelas condições de maturação. O terceiro objectivo consistia na integração das etapas de agregação e diferenciação de neurosferas de hmNPC num sistema em biorreactor controlado. Este sistema de cultura tem importantes vantagens em relação à cultura em erlenmeyer, tais como permitir o controlo e monitorização em tempo real dos parâmetros de cultura (pH, pO2 e temperatura), mantendo-os estáveis ao longo da cultura. Para tal, biorreactores de tanque agitado foram inoculados com uma suspensão celular, permitindo um processo de agregação eficiente durante 7 dias. No final deste período, a caracterização fenotípica das neurosferas revelou que permaneciam num estado proliferativo e indiferenciado. Seguiu-se um período de 14 dias de diferenciação e, no final do mesmo, as neurosferas revelaram uma baixa eficiência de diferenciação neuronal. Esta discrepância relativamente ao processo de diferenciação implementado em erlenmeyer poderá resultar nas diferenças entre os dois sistemas, nomeadamente em relação à dinâmica de agitação. Esta está directamente relacionada como a força hidrodinâmica a que as células estão sujeitas, o que pode influenciar a diferenciação das mesmas. Além disto, tanto o pH como também os níveis de pO2 ao longo da cultura poderão contribuir para este resultado, pelo que estudos relativamente aos efeitos dos mesmos terão de ser feitos com vista à optimização da cultura em bioreactor. Assim, a cultura em erlenmeyer foi o sistema escolhido para, numa primeira fase, proceder à avaliação da transdução de neurosferas diferenciadas com vectores CAV-2. Tendo em conta os últimos avanços no campo de engenharia de vectores para terapia génica, a eficiência de transdução e impacto na sobrevivência celular e composição das neurosferas foram avaliados recorrendo a um vector CAV de terceira geração (hd-CAV-2) codificando a proteína repórter eGFP. Estes são vectores CAV-2 aos quais foi retirado a totalidade dos genes virais, o que lhes confere uma maior capacidade de clonagem e uma incapacidade de replicação, propriedades vantajosas em cenários de terapia génica. Por último, e no sentido de desenvolver o potencial deste sistema de cultura como modelo de doença de Parkinson, procedeu-se à transdução de neurosferas diferenciadas com um vector hd-CAV que codificava para uma proteína LRRK2 com a mutação G2019S que foi associada à etiologia da doença). Para tal, foram utilizadas as condições de transdução optimizadas utilizando o vector hd-eGFP. Os resultados revelaram níveis baixos de expressão do transgene nas culturas transduzidas. Isto poderá indicar problemas com a preparação viral, nomeadamente no que respeita ao rácio entre partículas totais e partículas com capacidade infecciosa. No caso desta razão apresentar valores baixos, poderá em parte justificar os elevados níveis de toxicidade observados, assim como os baixos níveis de expressão de transgene. Portanto, testes mais rigorosos à qualidade da preparação viral terão de ser efectuados previamente ao prosseguimento dos estudos; adicionalmente, outros stocks virais serão testados. Em resumo, esta tese contribuiu para o melhoramento do processo de diferenciação de hmNPCs em sistemas de agitação orbital, nomeadamente em termos de duração do tempo de cultura e de maturação neuronal. Foi ainda possível implementar um processo em biorreactores de tanque agitado para a agregação de hmNPCs, ainda que a integração da diferenciação das neurosferas no mesmo sistema necessite ser completamente optimizada. Por último, contribuiu para a caracterização do processo de transdução com recurso a vectores CAV de terceira geração como veículos de manipulação genética, com potencial aplicação tanto em terapia génica como para o desenvolvimento de modelos de doença. Assim, o processo estabelecido nesta tese contribuiu para o desenvolvimento de um modelo celular robusto e reprodutível do SNC, o que poderá contribuir para o aumento da relevância de ensaios pré-clínicos, tanto no desenvolvimento de novos fármacos como na avaliação de vectores de terapia génica.Central Nervous System (CNS) disorders remain a formidable challenge for the development of new and efficient therapies. Gene therapy has emerged as a promising alternative in treating the causes of the disease, instead of merely ameliorating symptoms. For this, hd-CAV vectors have arised as suitable tools, due to the higher safety and lack of immunological memory. Preclinical research of CNS disorders, such as Parkinson’s disease (PD), has traditionally relied on animal models and 2D in vitro cell models, which fail in mimicking in vivo human phenotype. This represents the main obstacle for the translation of CNS drugs into clinical trials. Thus, the main aim of this thesis was the development a human CNS cellular model using human midbrain-derived neural precursor cells (hmNPCs). A protocol for differentiation of hmNPC neurospheres using stirred cultured systems with orbital shaking was already implemented. In this thesis, further characterization showed that the neurospheres were enriched in dopaminergic neurons and were functional, as assessed by detection of synaptic vesicle trafficking using FM1-43 probe. Moreover, this culture system was improved in terms of dopaminergic differentiation. By the end of differentiation, higher values the dopaminergic neuron markers of Nurr1 and TH were detected both at mRNA and proteins levels. Importantly, the improved protocol allowed neurosphere viability for long periods of time by adding a maturation period of 18 days, in which differentiation factors were removed from the culture. Also, a long-term 3D culture system for neural differentiation using controlled stirred-tank bioreactors was implemented, which allowed for aggregation of hmNPCs and is currently under optimization. Furthermore, the potential of third generation canine adenoviral vectors for genetic manipulation of this cellular model was evaluated. This can be of great value as a powerful tool for disease modeling, namely PD through overexpression of Leucine-rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) carrying the PD-associated mutation G2019S. Additionally, these hd-CAV vectors could have important applications in gene therapy

Perceção dos Enfermeiros Especialistas em Enfermagem Médico-Cirúrgica sobre a Prática Baseada na Evidência

Enquadramento: A prática baseada na evidência (PBE) integra a melhor evidência científica disponível com a experiência clínica individual do profissional, focando as preferências e valores da pessoa, de acordo com os recursos disponíveis. Constitui um pilar essencial ao incremento da eficácia e da segurança nas práticas em saúde, e à promoção da qualidade dos cuidados. Objetivos: Identificar as barreiras à PBE percecionadas pelos Enfermeiros Especialistas em Enfermagem Médico-Cirúrgica (EEEMC); descrever as práticas, atitudes e conhecimentos/competências dos EEEMC em relação à PBE. Metodologia: Estudo descritivo, de caráter quantitativo. Recolha de dados através de um formulário digital: I – Questionário de caraterização socioprofissional; II – Questionário de Atitudes e Barreiras face à Prática Baseada na Evidência (QABPBE-26); III – Questionário de Eficácia Clínica e Prática Baseada em Evidências (QECPBE-20), traduzidos e validados para Portugal por Pereira et al. (2015a, b). Amostragem não-probabilística por conveniência, que envolveu EEEMC em funções nos contextos de prática clínica a nível nacional. Análise de dados de acordo com a natureza das variáveis e com recurso ao SPSS versão 24. Resultados: A amostra final foi constituída por 218 EEEMC, que revelam o predomínio de atitudes favoráveis à PBE considerando que a sua implementação trará benefício para o seu desenvolvimento profissional. As barreiras à PBE destacadas foram a falta de incentivos, o défice de apoio por colegas peritos, a falta de formação, a falta de financiamento e de tempo. A dimensão “Atitudes” apresenta a média mais elevada (6,15), seguida dos “Conhecimentos/Habilidades e Competências” (5,09) e das “Práticas” (4,79). Conclusão: Os EEEMC valorizam a PBE, reconhecem os seus benefícios, demonstram conhecimentos e habilidades, contudo a sua implementação prática efetiva continua a ser um desafio. A aplicação de instrumentos de medida que possibilitam a avaliação das dimensões relacionadas com a PBE no contexto do exercício profissional dos EEEMC, permite identificar lacunas, delinear estratégias e planos formativos dirigidos, incrementando a incorporação da evidência na prática destes profissionais de referência.info:eu-repo/semantics/draf

Effects of a functional rehabilitation program designed by the arronches care unit for a patient with stroke: a case report

This study describes the effect of a Functional Rehabilitation Program (FR) designed for the recovery of stroke patients. A new FR approach for stroke patients was experienced obeying the internment protocol used in the Continuing Care Units Mean Duration and Rehabilitation. According to the law (DC 101/2006), the protocol includes the patient initial assessment and the design of an individual FR program of treatment developed until 90 days; moreover, suggests evaluations after 30 days of hospitalization and before day 90 (Girão & Guerreiro, 2011). Case Description: Patient aged 74 yrs, diagnosed with left capsular hematoma striatum due to ischemic stroke. Background: hypertension and alcoholism. In the initial evaluation, the patient was oriented in time and space, he showed left hemiparesis, hearing and visual acuity impairment, motor programming deficit, balance at setting position compromised, inability to walk, and high dependence in basic and instrumentals activities of daily living (BADLs and IADLs). Evolution prognosis: reserved. Intervention: The FR program (5 days/week) incorporated three areas: Rehabilitation Nursing (RN), Physiotherapy (P), and Psychomotor Rehabilitation (PR).The RN performed BADLs relearning with a nurse; the P used the Bobath method; and the PR, as innovation, combined the traditional Brunnstrom method with sensorimotor stimulation targeting ontogenetic reliving. Evaluations were performed in the pre-intervention (PI), after 30 intervention days, and at the end of the program - before day 90. BADLs were accessed using the Barthel Index, and the IADLs using the Lawton Index. Global mobility was measured using Mobility Scale for the Elderly (EMI) and the six minutes walking test. The patient improved BADLs (Barthel, score: PI = 14; 30 days = 37; 90 days = 62) and IADLs (Lawton score: PI = 0; 30 days = 5; 90 day = 7), as well as mobility (EMI score: PI = 0; 30 days = 6; 90 day = 11), having reacquired the walking ability (walking test: PI = 0 m; 30 days = 38 m; 90 day = 50 m). The performed interdisciplinary intervention showed positive effects on the recovery of the stroke patient; specifically induced increases in his mobility and ability to perform BADLs and IADLs. These results suggest that interdisciplinary RF programs including ontogenetic reliving would be effective for the recovery of stroke patients with poor prognosis of evolution

Lower limb edema caused by metastatic signet ring cell stomach cancer

Overall gastric cancer incidence is decreasing, but incidence of gastric signet ring cell carcinoma has been rising. The diagnosis can be challenging. It has a poorer prognosis because it tends to be diagnosed at advanced stages. Lymphedema is a rare presentation. We report a rare presentation of signet ring cell carcinoma in a 49-year old male, with no underlying medical condition. The patient presented with lymphedema of lower limbs, scrotum and abdominal wall

Nutritional intake and food sources in an adult urban Kenyan population

Publisher Copyright: © 2022 The Authors. Nutrition Bulletin published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of British Nutrition Foundation.Urbanisation is hastening the transition from traditional food habits to less healthy diets, which are becoming more common among Kenyans. No up-to-date studies on usual dietary intake and the main food sources of adult Kenyans are available. The aim of the present study was to identify the main food sources of nutrients in the diet of urban adult Kenyans and explore potential associations with demographic variables including age, sex, level of education, occupation and body mass index. The study adopted a cross-sectional design. The dietary intake of 486 adult Kenyans from Nairobi was assessed using a validated, culture-sensitive, semi-quantitative food frequency questionnaire. Binary logistic regression models were used to evaluate associations between food sources and demographic variables. Macronutrient intakes as a proportion of total energy intake (TEI) were within international dietary guidelines. Cereals and grain products (34.0%), sugar, syrups, sweets and snacks (9.8%), fruits (9.7%) and meat and eggs (8.8%) were the major contributors to TEI. Cereals and grain products contributed 42.5% to carbohydrates, followed by fruits (12.4%) and sugar, syrups, sweets and snacks (10.6%). The most important sources of protein and total fat were cereals and grain products (23.3% and 19.7%, respectively) and meat and eggs (22.0% and 18.7%, respectively). Sex, age and level of education were associated with the choice of food groups. Although macronutrient intakes were within guidelines, the Kenyan diet was revealed to be high in sugars, salt and fibre, with differences in food sources according to demographic variables. These results can act as an incentive to national authorities to implement nutritional strategies aiming to raise awareness of healthier dietary patterns among Kenyans.Peer reviewe

Prognostic value of Monocarboxylate Transporter 1 overexpression in cancer: a systematic review

Energy production by cancer is driven by accelerated glycolysis, independently of oxygen levels, which results in increased lactate production. Lactate is shuttled to and from cancer cells via monocarboxylate transporters (MCTs). MCT1 works both as an importer and an extruder of lactate, being widely studied in recent years and generally associated with a cancer aggressiveness phenotype. The aim of this systematic review was to assess the prognostic value of MCT1 immunoexpression in different malignancies. Study collection was performed by searching nine different databases (PubMed, EMBASE, ScienceDirect, Scopus, Cochrane Library, Web of Science, OVID, TRIP and PsycINFO), using the keywords “cancer”, “Monocarboxylate transporter 1”, “SLC16A1” and “prognosis”. Results showed that MCT1 is an indicator of poor prognosis and decreased survival for cancer patients in sixteen types of malignancies; associations between the transporter’s overexpression and larger tumour sizes, higher disease stage/grade and metastasis occurrence were also frequently observed. Yet, MCT1 overexpression correlated with better outcomes in colorectal cancer, pancreatic ductal adenocarcinoma and non-small cell lung cancer patients. These results support the applicability of MCT1 as a biomarker of prognosis, although larger cohorts would be necessary to validate the overall role of MCT1 as an outcome predictor.This work has been funded by National funds, through the Foundation for Science and Technology (FCT)-project UIDB/50026/2020 and UIDP/50026/2020 and by the project NORTE-01- 0145-FEDER-000055, supported by Norte Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF). A.S., M.C.C. and J.A. received fellowships from FCT, references 2022.11018.BD (A.S.), 2022.10233.BD (M.C.C.) and SFRH/BPD/116784/2016 (J.A.)

Needs of patients with mental illness in a community context

Taking into account the different circumstances that make up the community, it becomes a privileged context for the development of interventions in the field of health. It is expected that the person with mental illness, who is integrated in his community, develops skills that allow him an effective recovery, taking into account the importance of promoting recovery in this way. Knowing the perspectives of health professionals about the needs of these people is important for the development of intervention programs in the community and, thus, contribute to the promotion of recovery. MATERIAL & METHODS This paper aims to explore and describe the perspective of health professionals on the needs of people with mental illness. It is a qualitative and exploratory study, based on symbolic interactionism. A convenience sample of 7 health professionals from different areas of training and intervention was used. We chose a semi-structured interview as a data collection instrument. Data analysis was performed using content analysis according to Blumer's assumptions. RESULTS From the analysis of the narratives emerged four dimensions, which include subdimensions. In the Social Relations dimension, two sub-dimensions emerged: relationship with the family and relation with the environment; in the Disease dimension, five sub-dimensions were highlighted: therapeutic intervention with the family, therapeutic intervention with the person, therapeutic regimen, stigma and difficulties caused by the disease; in the Environment dimension, three sub-dimensions were distinguished: knowledge about resources in the community and accessibility, social integration and resources in the community; in the fourth dimension Health Services emerged three subdimensions: continuity of care, articulation between health services and communication between technicians / teams. CONCLUSIONS These results allow a broad understanding of the perspectives of health professionals on the needs of the person with mental illness. We can conclude that these needs are related to the different domains of people's lives, the difficulties being demonstrated in terms of family dynamics, work environment and social relations, and the difficulties in adherence and management of the therapeutic regime are also highlighted, such as difficulties in accessing support networks such as health centers or other outreach, or the inability of people to mobilize means of access to such networks. These results constitute a contribution to the implementation of intervention programs, which should also take into account the needs expressed by the people themselves, which is being studied in a parallel study.This article is a result of the project (NORTE-01-0145-FEDER-023855), supported by Norte Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Necessidades da pessoa com doença mental após alta hospitalar na voz dos profissionais de saúde

Introdução: tendo como referência os valores implícitos no Plano Nacional de Saúde Mental e a importância dos cuidados continuados e integrados, o recovery da pessoa com doença mental torna-se um forte objeto de estudo nesta área de intervenção. O recovery é um processo subjetivo, tendo como filosofia a recuperação clínica e pessoal. Neste sentido, saber quais as necessidades da pessoa com doença mental torna-se um objetivo primordial para se poderem desenhar programas de intervenção assentes nessa subjetividade. Objetivos: explorar a perspetiva dos profissionais de saúde sobre necessidades da pessoa com doença mental após a alta hospitalar. Material e Métodos: estudo qualitativo e exploratório, com base no interacionismo simbólico. Recorreu-se a uma amostra de conveniência de 7 profissionais de saúde de diferentes áreas de formação e intervenção. Optou-se por uma entrevista semiestruturada como instrumento de recolha de dados. A análise dos dados foi efetuada recorrendo à análise de conteúdo segundo os pressupostos de Blumer. Resultados: da análise das narrativas emergiram quatro dimensões, as quais incluem subdimensões. Na dimensão Relações Sociais sobressaíram duas subdimensões: relação com a família e relação com o ambiente; na dimensão Doença, destacaram-se cinco subdimensões: intervenção terapêutica junto da família, intervenção terapêutica junto da pessoa, regime terapêutico, estigma e dificuldades causadas pela doença; na dimensão Ambiente distinguiram-se três subdimensões: conhecimento sobre recursos na comunidade e acessibilidade, integração social e recursos na comunidade; na quarta dimensão Serviços de Saúde emergiram três subdimensões: continuidade de cuidados, articulação entre os serviços de saúde e, comunicação entre técnicos/equipas. Conclusões: estes resultados permitem uma compreensão alargada das perspetivas dos profissionais de saúde sobre as necessidades da pessoa com doença mental. Podemos concluir que estas necessidades estão relacionadas com os diferentes domínios da vida das pessoas. Constituem um aporte para a implementação de programas de intervenção, os quais devem ainda ter em atenção as necessidades expressas pelas próprias pessoas, aspeto que está a ser trabalhado num estudo paralelo.info:eu-repo/semantics/publishedVersio